注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
?
實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
TCEP；三-(2-甲酰基)膦鹽酸鹽NLRC4 (D5Y8E) Rabbit mAb四氟酸鋰

N，N-二甲酰(分子生物學(xué)級(jí))IL-1β (D4T2D) Rabbit mAb (Mouse Specific)2-氟-硝

硫代*五水(AR)Phospho-Smad1 (Ser463/465)/ Smad5 (Ser463/465)/ Smad9 (Ser465/467) (D5B10) Rabbit mAb (PE Conjuga)2--基-4,6-二甲基吡啶

化鈉(AR)Smad1 (D59D7) XP® Rabbit mAb (Biotinylad)2,5-二甲基-己炔-2,5-二

可溶性淀粉Phospho-Src (Ser17) (D7F2Q) Rabbit mAb2-溴-6-氟甲

硫脲Phospho-Bim (Ser77) (D4H12) Rabbit mAb1-N-Boc-吖丁啶羧酸

化鈷六水(分子生物學(xué)級(jí))Keratin 17/19 (D4G2) XP® Rabbit mAb1-Boc-基氮雜環(huán)丁烷

化鈷六水(AR)FIP200 (D10D11) Rabbit mAb2-溴-氟甲

酚,酚Phospho-DARPP-32 (Thr34) (D27A4) Rabbit mAb硫異煙

異戊CD82 (D7G6H) Rabbit mAb羥基

醋酸鋰，二水(AR)S5a/PSMD4 (D20B2) Rabbit mAb噻唑-2-甲酸

聚蔗糖400MTMR3 Antibody3,5-二氟芐酰溴

二硝基水楊酸PSMA3 (D4Y9O) Rabbit mAbS-Boc-氨甲基吡咯烷

二酸鈉CK1ε Antibody2-(叔丁氧羰基氨基)-哌啶

酸二氫鈉二水Puma (D30C10) Rabbit mAb1-Boc-磺酰氧基哌啶

二酸(AR)Puma (D30C10) Rabbit mAbN-Boc-羥基氮雜環(huán)丁烷

化錳四水LIS1 Antibody2-氟-5-(三氟甲基)酚

葡聚糖凝膠S-100 HRVDAC (D73D12) Rabbit mAb (HRP Conjuga)-基酚

豚鼠肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)ELISA試劑盒ECM1  細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1100 ul

豚鼠甘油-3-酸脫氫酶(GAPDH)ELISA試劑盒ECP  嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白100 ul

豚鼠干細(xì)胞因子/肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SCF/MGF)ELISA試劑盒ED-1  外胚層發(fā)育不良100 ul

豚鼠鈣調(diào)素(CAM)ELISA試劑盒EDNRA  內(nèi)皮素受體A100 ul

豚鼠端粒酶()ELISA試劑盒EEF2  真核翻譯延長(zhǎng)因子2100 ul

豚鼠膽囊收縮素/腸促胰酶肽(CCK)ELISA試劑盒Phospho-EEF2 (Thr56)  酸化真核翻譯延長(zhǎng)因子2100 ul

豚鼠膽脂酶(CHE)ELISA試劑盒EEF2k  真核延伸因子激酶2100 ul

豚鼠單核細(xì)胞趨化蛋白4(MCP-4/CCL13)ELISA試劑盒Phospho-EEF2k (Ser366)  酸化真核延伸因子激酶2100 ul

豚鼠單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1/CCL2/MCAF)ELISA試劑盒EGFR  表皮生長(zhǎng)因子受體100 ul
貓細(xì)小病毒PCR檢測(cè)試劑盒廠家干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體/細(xì)胞表面分化抗原抗體Ethyl 3-(4-methoxyphenyl)propaate中文名：別名：分子式：C12H16O3

軸突相關(guān)粘附分子抗體Decursidate中文名：別名：分子式：C18H18O6

鈣平衡調(diào)節(jié)蛋白1抗體Caffeic acid中文名：咖啡酸別名：分子式：C9H8O4

阿爾茨海默病淀粉樣蛋白相關(guān)膠原蛋白抗體Methyl 3-(4-methoxyphenyl)propaate中文名：別名：分子式：C11H14O3

老年癡呆相關(guān)類鈣粘蛋白CS1抗體4-Allylpyrocatechol中文名：4-烯丙基兒茶酚別名：3,4-Dihydroxyallylbenzene分子式：C9H10O2
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。